Adaptation de l'outil d'édition génomique CRISPR-Cas12a à la levure Pichia pastoris pour le développement d'une souche produisant des protéines humanisées

Pichia pastoris est un hôte d’expression de protéines recombinantes dont l’utilisation gagne en importance. Son intérêt réside notamment dans sa capacité à réaliser des modifications post-traductionnelles, essentielles à la bioactivité des protéines, dont la N-glycosylation. Cependant, le patron de N-glycosylation des protéines produites par cette levure diffère de celui observé dans les cellules humaines. Il apparaît que l’humanisation de ce patron est possible par l’inactivation du gène codant une mannosyltransférase, le gène och1. Or, cette inactivation ralentit la croissance de la levure, ce qui s’avère problématique en termes de durée et de coûts de production pour des protéines d’intérêt industriel. La mise au point d’une souche dont l’inactivation de och1 pourrait se faire sur demande et seulement au moment de la production d’une protéine permettrait de contourner ce problème. Une telle souche pourrait être développée en exploitant le système CRISPR-Cas, un ciseau moléculaire capable d’altérer une séquence ciblée. Bien que Cas9 est l’endonucléase la plus populaire, elle est toxique pour certains microorganismes, dont P. pastoris, et elle manque de précision. Cas12a (Cpf1), récemment identifiée et décrite, est une alternative intéressante puisqu’elle ne semble pas être toxique tout en étant plus précise que Cas9. Bien que cette endonucléase soit utilisée chez plusieurs microorganismes, elle n’a pas été adaptée à P. pastoris à ce jour. Son adaptation à ce microorganisme permettrait l’utilisation d’un outil essentiel à l’ingénierie de la levure tout en permettant la mise au point d’un système d’inactivation inductible d’un gène de la voie de N-glycosylation.
L’objectif général de ce projet consiste ainsi à adapter CRISPR-Cas12a pour l’inactivation d’un gène, puis à exploiter cet outil pour développer une souche dont la N-glycosylation est réduite sur demande. Pour y arriver, l’expression des deux composantes de ce système, Cas12a et un court ARN dirigeant l’enzyme (crRNA) sera optimisée pour P. pastoris. Le système optimisé sera ensuite utilisé pour inactiver un gène contrôle (gut1), puis le gène d’intérêt (och1). Cette inactivation pourra se faire sur demande suite à l’ajout d’un agent inducteur. Enfin, la souche mise au point sera utilisée pour produire une protéine d’intérêt pharmaceutique et médical, l’herceptine, pour évaluer l’importance de la réduction de la N-glycosylation.
Ce projet présente un fort potentiel de retombées sur la formation collégiale et sur la formation de personnel hautement qualifié. Il permettra l’intégration de contenus théoriques et pratiques sur la technologie CRISPR-Cas dans au moins deux programmes d’études collégiales. Par le biais de l’implication de stagiaires, il contribuera à la spécialisation d’étudiants en lien avec la modification génétique. Il élargira aussi l’expertise du personnel technique du CNETE. Il permettra d’offrir aux utilisateurs un outil simple et efficace pour la modification génétique de P. pastoris. Enfin, les connaissances développées seront réinvesties dans la poursuite de collaborations entre le CNETE et divers chercheurs universitaires.